臨床執業醫師考試病理學知識點精講

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第十九節 免疫性檢測技術

大綱要求：

1.抗體的檢測及應用(1)概念(2)沉淀反應(3)凝集反應和血型的鑒定(4)免疫熒光(5)放射免疫(6)酶免疫(elisa和免疫組化)(7)化學發光(8)免疫電鏡(9)免疫沉淀(10)免疫印跡(11)親和層析

2.免疫細胞的分離(1)ficoll-hypaque離心法(2)磁珠分離法(3)流式細胞術

3.免疫細胞的特異性、數量和功能檢測(1)流式細胞術(2)酶免疫斑點試驗(3)細胞因子的細胞內染色(4)四聚體法(5)增殖試驗(6)細胞毒試驗(7)細胞凋亡檢測(8)芯片技術(9)細胞因子的生物活性檢測

講義內容：

一 抗體的檢測及應用抗體進行的檢測

1. 概念：免疫學檢測的基本原理是抗原-抗體的特異性結合，其特點為：高特異性、可逆性、抗原抗體濃度和比例決定出現免疫復合物的性狀不同。

2. 根據抗原物理性狀差異或參與的輔助成分的不同，可出現不同的反應，包括：

(1) 凝集反應

(2) 沉淀反應

(3) 中和反應

常稱為血清反應。

3. 沉淀反應：毒素等可溶性抗原和相應特異性抗體以合適比例結合，出現肉眼可見的沉淀物，稱為沉淀反應，一般在液體中和半固體瓊脂凝膠中反應。

(1) 免疫比濁法：一定量抗體中分別加入相應遞增量的可溶性抗原，抗原抗體結合形成數量不等的ic，使反應體系呈現不同的濁度。當抗體含量固定且過剩時，免疫復合物的多少(濁度)可提示抗原濃度，通過自動化濁度儀，可同時檢測樣品中多種分子并進行精確定量分析。快速、簡便，常用于檢測轉鐵蛋白、尿微量蛋白及各種免疫球蛋白和補體

(2) 單向免疫擴散：將已知一定濃度的抗體均勻混合于42-50℃已經熔化的瓊脂中，制成凝膠板。隔適當距離打孔，加入被檢測可溶性抗原，使其向四周擴散;抗原與瓊脂中的抗體相遇，一定時間后，在比例適宜處形成肉眼可見的白色沉淀環，由于沉淀環的直徑與抗原濃度相關，可查標準曲線，找出抗原含量，可用于血清中免疫球蛋白g、c3、afp和其他可溶性抗原定量檢查。

(3) 雙向免疫擴散：在瓊脂班上相鄰的兩孔中分別加入抗原和抗體，使其在瓊脂中擴散，兩者比例適當時，可在兩孔間的適當位置形成白色沉淀線，常用于檢測：抗原或抗體的定性;對復雜的抗原或抗體成分進行純度鑒定;血清免疫球蛋白的效價測定(半定量)。

(4) 免疫電泳：先將待測抗原樣品進行瓊脂糖凝膠電泳，使不同的組分依據電泳速度不同分散，而后在樣品泳道一側的適當距離處挖一和泳道平行的直線溝槽，在槽內加入已知抗體，讓抗體和抗原進行雙向免疫擴散，在泳道和槽的中間形成沉淀線，可用于血清蛋白的組分分析，如免疫球蛋白增多疾病的診斷;對流免疫電泳：抗原、抗體同時電泳，中間形成沉淀線。

4. 凝集反應和血型鑒定：顆粒性抗原(細菌、紅細胞、偶聯抗原的乳膠顆粒)與相應抗體結合后出現肉眼可見的凝集現象，稱為凝集抗原

(1) 直接凝集：顆粒性抗原與相應抗體結合后產生的凝集反應 。可鑒定細菌和血型如玻片法為定性試驗，常用于菌種鑒定或人類abo血型的鑒定。試管法常用于抗體效價的檢測。

(2) 間接凝集：將可溶性抗原或抗體包被在紅細胞或乳膠顆粒載體表面后，與相應抗體或抗原作用出現的凝集。顆粒載體有紅細胞、聚苯乙烯乳膠顆粒，相應間接凝集現象稱為間接血球凝集、間接乳膠凝集，如類風濕因子的檢測(人igg吸附在乳膠顆粒)，將已知抗體吸附在載體上的凝集稱為反向間接凝集，如rh血型不符檢測中對患者抗紅細胞rh抗原igg的檢測。

(3) 提高靈敏性的辦法:已知抗體或抗原標記上酶、熒光素、放射性核素、膠體金等，可進行定量檢測，并可檢測在組織細胞中的定位和分布。

5. 免疫熒光：用熒光標記的抗體或(抗原)分子檢測相對應的抗原或抗體分子的技術。常用的熒光素包括fitc、藻紅蛋白(pe)在激發光作用下可分別發綠色或紅色熒光，在病原體的診斷、細胞表面cd標志的鑒定等方面用途廣泛

(1) 直接熒光法 把熒光素直接標記的抗體與待檢細胞或組織切片相互作用，測定未知抗原，用熒光顯微鏡、流式細胞儀或con-focal進行觀察及鑒定

(2) 間接熒光法 將特異性抗體與待測抗原相互作用后，加入熒光素標記的抗一抗抗體，既可檢測抗原又可檢測抗體。

6. 放射免疫：用放射性核素標記抗原或抗體進行的免疫測定，同位素的高度敏感性使該方法具有重復性好、準確度高的優點，廣泛用于激素等微量物質和ctl功能的檢測，敏感性可高達pg/ml的水平,常用的有125i等

7. 酶免疫(elisa和免疫組化)：酶標記一抗或二抗檢測特異性抗原或抗體的方法;將抗原抗體反應的高度特異性與酶對底物的高效催化作用結合起來，通過酶分解底物產生有色物質(或熒光)，用酶標儀測定光密度值，反應抗原或抗體的含量，常用hrp、alp。

(1) elisa：將抗原或抗體與固相載體(聚苯乙烯)結合，加入待測抗體或抗原，最后以酶標二抗和底物進行檢測的技術。簡單、快速、特異性強，用于檢測抗原和血清抗體效價，最常用

雙抗夾心法：檢測液相中的可溶性抗原，包被抗體，洗去未吸附抗體，加入待測抗原，37℃1h,抗原與固相抗體結合，洗去未結合抗原，加入酶標二抗，加入底物顯色，檢測od值地阿姨奧抗原抗體的量和效價

間接elisa：已知抗原包被，加入待檢抗體，然后加酶標二抗，洗滌后加底物檢測

(2) 免疫組化：應用標記的特異性抗體在組織細胞原位(冰凍或石蠟切片)通過抗原抗體反應和酶-底物的顯色反應，用于定位、定性、定量檢測組織或細胞中的抗原，具有免疫反應的特異性和組織化學的可見性。

8. 化學發光：用發光物質標記的抗原或抗體檢測抗體或抗原的方法，結果用發光光度計檢測。具有發光分析高靈敏性，分離簡單，自動化分析，發光酶免疫分析、化學發光免疫分析、電化學發光分析

9. 免疫電鏡：免疫技術與電鏡技術相結合，在超微結構水平觀察抗原、抗體結合定位的方法。利用帶有特殊標記的抗體與相應抗原相結合，形成一定電子致密度的復合物，電鏡下觀察定位。

10. 免疫沉淀：研究蛋白相互作用的經典方法

12. 免疫印跡：(western blotting)

13. 親和層析：利用分子間專一的親和力來分離或純化蛋白質的技術，將親和對中的一個固定在基質上，制成分離柱，利用分子間親和的特異性和可逆性，進行分離純化。

二 免疫細胞分離

常用于包括人外周血單個核細胞(pb-mc)、脾臟淋巴細胞和淋巴結淋巴細胞分離，pb-mc最常用，t、b分離第一步。

1. ficoll-hypaque離心法：

(1) 葡聚糖-泛影葡胺密度梯度離心法是分離制備pbmc最常用方法;根據外周血中各種血細胞比重不同使不同密度細胞呈梯度分布。

(2) 抗凝血疊加于分離液上，低速離心，細胞分層

rbc：管底;pbmc：血漿層與分離液界面;最上層：血漿，plt懸浮其中;利用單核細胞粘附塑料的特性，可從pbmc中除去

2. 磁珠分離法：利用免疫磁珠(特異性抗體與磁性微粒的交聯物)進行特異性淋巴細胞分離的方法;將cd4/cd8等特異性抗體吸附在磁性微珠上，加到細胞懸液中，與具有相應抗原的細胞結合，在置于磁場中，攜帶有相應細胞的免疫磁珠吸附于靠近磁鐵的管壁，即可分離，得到細胞。

3. 流式細胞術：利用熒光活化細胞分析儀(facs)通過細胞表面cd分子的檢測而對細胞進行分類和定量的方法;熒光素標記的mab與細胞表面特異cd分子結合，而后將細胞液滴射流經流動室噴嘴以單個細胞噴出，并經高速聚焦激光照射，以激發熒光顏色和強度標識是否具有相應cd分子，可鑒定、分離不同細胞，可單色、雙色、多色，進行周期、凋亡分析。

三 免疫細胞的特異性、數量和功能檢測

1. 流式細胞術(fcm)：根據表面表達cd分子的種類、水平和多種cd表達格局，以流式細胞術可以二維熒光方圖和比例統計顯示待測細胞群體中某群cd+細胞的比例及數量、cd分子表達的水平高低，同時以ifnγ等因子或annexinv 凋亡標志,可以測定的功能性ctl、凋亡細胞的比例，以fitc標記靶細胞，通過熒光強度的減弱程度可測定ctl的殺傷活性。

2. 酶免疫斑點試驗(elisapot)：功能性細胞(分泌細胞因子)的定量檢測;用細胞因子的抗體包被硝酸纖維膜(nc)或聚二氟乙烯(pvdf)覆蓋96孔板，加入待檢細胞，經抗原特異性刺激后，功能性細胞分泌細胞因子，可被包被的抗體捕獲。加抗細胞因子的二抗、生物素-親和素放大系統、酶及底物顯色后，板底分泌相應細胞因子的細胞所在局部產生有色斑點,一個斑點代表一個分泌相應細胞因子的細胞,根據斑點數量判斷功能性細胞的數量;根據斑點深淺,判斷細胞因子的相對含量。

3. 細胞因子的細胞內染色：功能性細胞的facs定量分析;首先特異性抗原刺激t細胞分泌細胞因子，而后用fitc-cd4染色，同時阻斷細胞因子分泌，加入穿膜劑，再加入抗細胞因子單抗(pe標記)，最后facs檢測同時激發紅、綠色細胞亞群，及分泌相應細胞因子的cd4+t細胞。

4. 抗原肽-mhc分子四聚體法：定量分析抗原特異性ctl的facs新技術;特異性抗原肽、可溶性mhci類分子重鏈及β2微球蛋白在體外正確折疊，借助生物素-親和素原理，構建1個熒光素標記的親和素

（責任編輯：中大編輯）